NGS 定序分析報錯 : 那些分析時遇到的蟲子們 -21

瀏覽次數: 54

沒有寫過程式就不會遇到 BUG

本篇介紹執行定序分析常見的報錯情境，而報錯的方式千百種，查詢解決方法就一種: 錯誤訊息複製起來，扔到 ChatGPT 就對了，不過總有特別頑固又印象深刻的錯誤，這邊分享幾種曾經遇過特別的報錯:

情境舉例 A: An error was encountered while running DADA2 in R (return code 1)

這應該是最常見也是頭最疼的一個報錯，DADA2 是負責品質管制的 R 套件，頭疼的原因是永遠報錯都是 return code 1(難道沒有其他數字了嗎 ! )，不會直接顯示真正的錯誤訊息，注意看會有一行紅字 :

Debug info has been saved to /tmp/XXXXXXXX.log

此時複製路徑並輸入，就能夠一窺它壞掉的原因了:

head /tmp/XXXXXXXX.log

情境舉例 B: Mismatched forward and reverse sequence files

'Filtering Error in (function (fn, fout, maxN = c(0, 0), truncQ = c(2, 2), truncLen = c(0,  : Mismatched forward and reverse sequence files: 3296, 4292.'

這情況會發生在抓取公開文獻的序列資料來分析時遇到的 Bug ，主因是 NGS 雙尾定序 (Pair-end)原始資料兩邊序列不等長，為什麼會不等長可能要問問作者或神奇海螺，解法如下:

調出 QIIME2 錯誤報告資料夾

qiime tools export \ 
--input-path demux.qza \
--output-path debugging

切換到 debugging 資料夾
```
cd debugging
```

列出該批待處理樣本檔名與序列長度資訊

for f in *.fastq.gz; do r=$(( $(gunzip -c $f | wc -l | tr -d '[:space:]') / 4 )); echo $r $f; done

看起來會像是這樣 (示意圖):
回去一開始觀察錯誤訊息，若有 3296, 4292 出現在列表中，建議直接到 manifest.tsv 移除那對樣本，不要分析它了，請學會放下它，執著並不符時間成本。Reference : forum.qiime2.org

情境舉例 C: Alpha Beta 多樣性分析結果，有樣本缺失 (E.g. 跑 5 個出來 4 個點)

這是因為取樣深度 (sampling depth) 調得太高的關係，觀念參閱 [第 15 篇] !

NGS QIIME2 次世代定序分析
- 解法: 參閱 [第 16 篇]