複習與了解 16S rRNA
在前幾天知道了 16S rRNA 菌相資訊的應用、二代 (NGS) 定序方式，以及定序後序列資料下載，如果要一言以蔽之本系列文就是: 用 16S rRNA 做定序、分析獲得菌相資訊。看來，我們剩下兩個名詞沒有介紹，分別是被提了N次的 16S rRNA 還有分析:
✏️ 16S rRNA 結構
在原核細胞 (Prokaryotic) 核糖體 (ribosome) 含有 rRNA，可以分成位於大次單元 (LSU) 的 5S 、23S rRNA (約2900 nt)，位於小次單元 (SSU) 的 16S rRNA (1542 nt)。其中小次單元中的 16S rRNA 引起科學家高度興趣:
在物種演化過程，16S rRNA 在短短 1542 nt中，不同物種間有些區段的序列出現差異，但也有一直保持不變的。有差異的部分稱為 : 變異區 (Variable Region)，分為 V1~V9，上圖紅色區，一直保持不變的稱為 : 保守區 (Conserved Regions)，上圖藍色區。
如果你做過 PCR 可以想想若將 Primer 設計在保守區，就可以夾到各種變異區的序列，而且還通用各物種 (萬用 Key)，是不是超棒的東東 ! 於是科學家就拿著各種 Primer 試圖夾出各種菌種的變異區序列，
Primer 是上圖綠色 (Forward)、橘色 (Reverse) 箭頭，仔細看他們都從保守區出發。
夾到的片段再經由定序之後，將其獨一無二的序列與物種階層連結，這就是分生鑑種的技術。
✏️ 16S rRNA V3-V4 變異區雙尾定序 (V3-V4 region pair-end sequencing)
次世代定序雖然可以達到高通量 (大量序列讀取)，但是每次讀取的長度有限 (單條超過 300 bp 品質就會急速下降)，所以無法快樂的從 V1 一路定到 V9 (>1400 bp)。如今第三代定序解決了這個問題，這個我們之後會提及。
而科學家發現 V3-V4 區域 (約 470 bp) 在原核生物變異性很大，在解析度 (resolution) 上足以辨別出各式各樣的菌，但是超過 300 bp 品質就岌岌可危了 怎麼辦可好 ? 於是 Illumina Miseq 提出了 Pair-end sequencing 解決方案:
採用了 337F 及 805R 兩種 Primer 從兩端夾攻，這樣就獲得了兩條約 250 bp 的序列 (R1, R2)，由於定序剛開始與結束的兩端品質都會比較差，分別從兩端定序的序列也因此補足中間品質差的問題:
✏️ 分析
長度問題處理好了，漸漸的，研究人員擬定了一系列 16S rRNA 鑑種的 Pipeline (分析流程)，除了能知道序列是屬於什麼菌，也想了解群體間的組成、差異 (物種多樣性等)。QIIME2 這套軟體就這樣誕生了，接下來二十幾篇都會講這個部分。
QIIME2 (念起來像 Train2) 是一款用於分析微生物菌相的軟體，輸入端 (Input) 是定序出來的原始檔案 (.fastq)，並輸出 (Output) 各類表格與視覺化檔案 (.tsv, .csv, .qzv, .qza) (Bolyen, Evan, et al., 2019)。除了 QIIME2 外，也會搭配一些插件與有趣的工具，讓整個視覺化之旅變得更豐富~
NGS 分析流程概述
在開始安裝前，我們先了解 QIIME2 能夠帶給我們什麼?
1. Denoise (Quality Control, QC)
篩選可信度低的序列，留下品質好的序列。
2. Taxonomy Classification
像是查字典般，利用資料庫與分類器，找出每條序列所對應的菌名(階層)
3. Diversity Analysis
將樣本內、樣本間的菌種們，進行多樣性分析
N. Functional Prediction
後來很多插件工具因應 QIIME2 而生，可以使用 QIIME2 產出的檔案，進行代謝途徑、酵素預測，能更清楚這些菌平時在環境中扮演的角色是什麼。
