NGS QIIME2: 定序資料加工壓縮 (Artifacts) 與概述 (Overview) 視覺化 -7

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壓縮成 QIIME2 artifacts (.qza) 分析專用格式

在整個分析流程中，輸入的檔案必須轉換為 QIIME2 artifacts (.qza) 壓縮格式，這類型檔案之後會在一個一個分析流程中穿梭，而 .qza 是一種電腦看得懂，人類看不懂的玩意兒，a 指的就是人為加工過的檔案 (artifacts)。

_{可以想成將定序資料與註釋包裝的集合檔案。}

那資料視覺化呢? 部分的 .qza 檔案有提供轉換為 .qzv功能，v 指的就是視覺化 (visualization) ，各種美美的圖都會從.qzv 跑出來! ~~變成電腦看不懂，人類看了很喜歡的玩意兒~~，因此接下來 .qza .qzv 兩個靈魂檔案格式會充斥本系列文 !

首先，必須先拎著 [Day 06] 所得到的三個檔案，

定序的原始檔案 (.fastq.gz)
樣本清單 manifest.tsv
註釋資料 sample-metadata.tsv

將三者轉換為一個 QIIME2 artifacts (.qza)，幫助匯入，先啟動 qiime2-2022.8 環境 :

conda activate qiime2-2022.8

匯入 (Importing)

第一步先將上述三個檔案匯入轉換為 .qza:

qiime tools import \
--type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
--input-format PairedEndFastqManifestPhred33V2 \
--input-path manifest.tsv \
--output-path demux.qza

import: 使用 qiime 軟體插件為 tools 的 import 函式
–type: 16S 定序主流以 PairedEnd 為主 [詳情]
–input-format: Phred33V2 是一種對序列品質分數表示格式
–input-path: manifest.tsv 的所在路徑
–output-path: 轉換產出的 .qza 的檔名與路徑
實務上，定序檔案若是來自文獻、廠商，回到手上時多已拆分 (demultiplex) 完畢，所以跳過拆分步驟 (Barcode 部分我習慣在 QC 部分處理)，以 demux.qza 命名，如有需要可以看這裡。

完成後會顯示:

"Imported manifest.tsv as PairedEndFastqManifestPhred33V2 to demux.qza"

demux.qzv 視覺化 (visualization)

接下來我們將迎來第一個視覺化資料:
剛剛得到 demux.qza 轉為 .qzv，
輸入 :

qiime demux summarize \
--i-data demux.qza  \
--o-visualization demux.qzv

完成後會顯示 :

"Saved Visualization to: demux.qzv"

將 demux.qzv 下載後拉到 QIIME VIEW 網站的框框，
就會跑出漂漂的 data ~ QIIME VIEW 可以直接加進我的最愛，之後會超常用到 !

資料解讀

Overview 確認樣本名稱、數量與條數

在這裡可以看到所分析的檔案名稱、數量與條數，因為定序時來回讀取，資料上會有 Forward 與 Reverse，通常會相同，因為我還沒見過不同的 XD 在這裡要做的是資料的確認，看有沒有漏上傳或是打錯的名字。

Interactive Quality Plot 序列品質查看

這個頁面非常重要，會影響到下一步要做的品質管制 (Quality Control)，橫軸為每一條序列的長度，根據 第五篇文章 我們知道，序列長度取決於要 Primer 夾取哪個片段，範例中所使用的夾取 V3-V4 片段的 Primer (可以從 Paper 得知)，長度大約是 470 bp。

因為含有 adapters 緣故，加上兩條必須 overlapping 才能組裝，所以單條序列長度會達到 250 bp，合起來會超過 470 bp (約 500 bp)。因此在這圖中就可以看到橫軸長度約為 250 bp，縱軸則為 Quality Score (Q Score) 品質分數，代表著機器根據每個 mer 讀取到的螢光，所給予的品質分數。

這張圖說明了 Q Score 分數的意涵，以 Q Score 20 來說，代表有 99% 肯定這個 mer 是 A/T/C/G，在次世代定序中 Q Score > 25 就不錯了!

Reference : wikipedia

還可以將圖框起來放大特定區域 (左)，會發現其實每個 base 都是一根根的四分位距圖 (右)，每個 base 都是根據所有序列條數 (sequence counts) 品質所繪製出來的結果 !

在下一步前，先決定要切多少 : Trimming 修剪序列

如果有些 base 的 Q Score < 25 怎麼辦呢 ?

這通常會發生在序列的一開始與結束，這時候就要決定要留多少的 nt，進行後續分析。生科人如果曾經送過 Sanger 定序確認基因重組 / Primer夾取結果，像是加 His Tag, Plasmid 或是切膠定序確認:

報告中會看到定序剛開始與結束訊號的不穩定，導致訊號混亂，就會看到這種圖案。

直到中間序列才會逐漸穩定。

次世代定序也是如此，頭尾的訊號也會相較中段不穩定，因此需要進行修剪。
Reference

以範例來說，我習慣選擇 :

中位數 Q Score > 25 以上序列，
切除開頭前 10~30 nt，
實務上很常遇到不知道有無切除 Barcode，所以乾脆都切掉~
如果很肯定不含有，可以切 5~10 nt (Q Score < 25)即可。
Forward、Reverse 盡量切等長，
避免後續 QC 兩序列無法互相組裝，
在這例子上，我們留下 10~250 nt ，抄在便條紙上，下回會用到。

本篇使用到的輸入/輸出檔案 :
Input: .fastq.gz、manifest.tsv、sample-metadata.tsv
Output: demux.qza、demux.qzv

下回修剪序列與看品質管制 (Quality Control) 結果 !