NGS QIIME2: DADA2 序列品質管制 – 留下好序列，篩掉壞序列 -8

DADA2 序列品質管制 – 留下好序列，篩掉壞序列

品質管制 (Quality control) 是序列分析重要的一環，為了有系統地留下好序列，DADA2 這個套件包被發明了出來，將 QC 分為修剪 (trimming)、過濾 (filters)、降躁 (denoises)、合併 (merge)、去除重疊 (dereplicates)，而 QIIME2 則收錄了 DADA2 讓一切變得更容易。

還記得在 第七篇 中我們獲得了一張便條紙，上頭寫著每條序列都只留下 10~250 nt 片段，因此接下來指令中會需要修剪序列。

然而，每個樣本中都有上萬條序列，裡頭也可能有品質不佳、為了合併而重疊的序列，就需要過濾、降躁、合併、去除重疊，原本的序列們就會像是經過漏斗層層篩選，最後就會剩下好的序列。

品質管制 (Quality control)

• 記得先啟動 qiime2-2022.8 環境
  • conda activate qiime2-2022.8

將 第七篇 獲得的 demux.qza 拎來處理處理:

qiime dada2 denoise-paired \
  --i-demultiplexed-seqs demux.qza \
  --p-trim-left-f 10 \
  --p-trim-left-r 10 \
  --p-trunc-len-f 240 \
  --p-trunc-len-r 240 \
  --o-table table-dada2.qza \
  --o-representative-sequences rep-seqs-dada2.qza \
  --o-denoising-stats stats-dada2.qza \
  --p-n-threads 8

qiime dada2 denoise-paired: 使用 qiime 軟體 插件為 dada2 的 denoise-paired 函式
–i-demultiplexed-seqs : 輸入的檔案
–p-trim-left-f / –p-trim-left-r: Forward/Reverse 序列起始端切多少，範例是 10 bp
–p-trunc-len-f / –p-trunc-len-r: Forward/Reverse 序列剪切後的總長度，範例末端切 0 bp，所以 240 ~
–o-table: 輸出的檔案
–o-representative-sequences: 輸出的檔案
–o-denoising-stats: 輸出的檔案
–p-n-threads: 要運算的核心數，因設備而異，不清楚可不加這行。調整為 0 就是全力跑╰(°▽°)╯
Reference

完成後會顯示:

'
Saved FeatureTable[Frequency] to: table-dada2.qza
Saved FeatureData[Sequence] to: rep-seqs-dada2.qza
Saved SampleData[DADA2Stats] to: stats-dada2.qza
'

輸出的檔案視覺化

輸出產生的檔案除了會做為之後分析的輸入檔案外，也可以做視覺化輸換 (.qzv)。輸入 :

qiime feature-table summarize \
  --i-table table-dada2.qza \
  --o-visualization table-dada2.qzv \
  --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv

qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs-dada2.qza \
  --o-visualization rep-seqs-dada2.qzv

qiime metadata tabulate \
  --m-input-file stats-dada2.qza \
  --o-visualization stats-dada2.qzv

完成後會顯示:

"Saved Visualization to: table-dada2.qzv"

"Saved Visualization to: rep-seqs-dada2.qzv"

"Saved Visualization to: stats-dada2.qzv"

資料解讀 – 以 stats-dada2 qzv 為例

table-dada2 與 rep-seqs-dada2 兩檔案，會在後續介紹到，我們先來提提常觀察的 stats-dada2:

輸入 Input

一開始的尚未進行任何處理的序列總數。

過濾 Filter

目的: 移除有太多低品質(Quality score) mer 出現的序列。
The maxEE parameter sets the maximum number of “expected errors” allowed in a read.
可以想成累加錯誤值，會針對每條序列的每個 mer Quality score 換算為分數進行累加，Quality score 越低，分數則越高，舉例來說 (分數僅示意)，若 Quality score 分別為 10, 20, 10, 20, 30…分數則為 0.1 + 0.01 + 0.1 + 0.01 + 0.001 + … + ，整條序列若累積的錯誤分數達到閾值(預設為2)，則該條序列就會被拋棄。

降噪 Denoised

目的: 移除 PCR 放大與定序過程中出錯的序列。
像是聚合酶 (Polymerase) 偷懶跳過、引子 (Primer) 亂亂黏，或是溫度條件不穩造成的循環 (Cycle) 未完成即到下一個循環等，都會導致錯誤的序列被製造與放大，會在這個步驟透過演算法篩選。

Reference: QIIME2 Youtube

合併 Merged

目的: 移除 Forward、Reverse 合併時組不起來的序列。
第五篇 中提及雙尾 (pair-end) 是藉由兩段序列組裝成帶有 V3-V4 區的序列，

若兩段序列的重疊區域因為各種原因，如品質過低、剪切過多 (如圖示 trimming)，都會造成序列合併時找不到另一半，找不到另一半的序列就會被淘汰 (bad) QQ

Reference : ISB Microbiome Course 2020

非嵌合體 Non-Chimeric

目的: 移除因為 PCR 溫度條件出現的嵌合體序列

Reference : ISB Microbiome Course 2020

在 PCR 擴增 (Amplicons) 過程中，每一個循環的溫度相當重要，如果可愛的聚合酶在複製的過程中，PCR 機溫度或是其微環境頑皮了，導致聚合酶來不及複製完 (圖示 B)，就會出現大大大大大 Primer (圖示 C)，並在下一個循環中製造出嵌合體(chimera) (圖示 D)。

經歷層層篩選後的序列，就會成為後續分析的主力，剩下被移除的序列就會消失在這地球上。上述每一步是經由一系列演算法才得以達成，有興趣可以閱讀這篇 Medium，也歡迎拜讀開發者 (Callahan, Benjamin J., et al., 2016)，這邊以好讀版為主。

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本篇使用到的輸入/輸出檔案 :
Input : demux.qza
Output: table-dada2.qza、rep-seqs-dada2.qza、stats-dada2.qza、table-dada2.qzv、rep-seqs-dada2.qzv、stats-dada2.qzv

下回是常見錯誤篇，從 stats-dada2 看剪切有沒有問題 !