定序的迭代
「定序」就是將一段序列判讀出 ATCG 排列的順序，「迭代」則是為了接近最終目標而反覆改良的過程。為了能精準有效率知道生物的基因序列，DNA 定序技術一代一代的不斷精進改良。
定序的歷史其實很有趣，從利用嗜菌體定序、2D電泳，人類基因組計畫之民間與政府的技術競賽，故事於網路上資源相當多就不再贅述。這邊則以 1977 年 Sanger 大師發明 Chain-termination 為界線，往後介紹人類解開生物程式碼的逆向工程。
第一代定序 Sanger Sequencing
又名 Sequencing-Based Typing
- 將樣本加熱，使 DNA 雙股打開
- 將有興趣的片段複製變多，以此得到一大堆有興趣的片段 (用一般的 PCR 放大特定片段)
- 加上引子 (Primer)
- 準備 4 個管子，皆含有聚合酶，dNTP，
但分別加入 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP 在不同管子 (以4種顏色示意) - 開始合成 (PCR)，過程中聚合酶合成某片段時，若抓到 ddNTP 的材料，會使得下一個 cycle，該片段因聚合酶無法繼續延長而終止
- 因為遇上 ddNTP 的機率是隨機，最終管內會有長度不一個 DNA 片段 (末端含有 ddNTP )，然後將原始 Template (模板)移除
- 把 4 個管分別跑在不同 well 的膠上，開始跑電泳~
- 由下往上讀，就是目標DNA的序列啦!
其採用的原理是 Chain-termination，也就是藉由合成中終止的方式，獲得長度不一片段，用跑膠判斷序列：
次世代定序 NGS – 以 Illumina 為例
為了解決長片段、大量定序需求以及效率低落等等心累的問題，經歷多家廠商的競爭，Illumina 公司開發的新技術成功打贏市場，目前 RNA seq、Single cell sequencing、Whole genome sequencing、Metagenomic (16S, 18S 等等)，主流都採用 Illumina 的 NGS，他們的原理相同，差別在於樣本的前處理 (e.g 轉 cDNA or 夾16S) 以及後續分析軟體的流程。而 Illumina 採用的原理是 Bridge amplification + Sequencing by Synthesis (SBS)，
接下來，了解下列步驟非常重要，因為後續分析會用到步驟中很多的觀念 :
Part A – 前處理
- 將 DNA 樣本打碎 (約 80 bp) (第一次看到先打碎序列其實蠻反邏輯的XD
- 加入Adapters，並使用連接酶加在序列片段頭尾 (可以想像改良過的 Primer，差別是頭尾都有，後續可以幫助放大片段)
- Adapters = 目標序列結合位 (sequencing binding site) (綠)
- indices(黃、紅) + oligos 互補序列 (紫、藍)
oligos 互補序列就是為了跟草皮 (lawn) 小草 (oligos) 結合 - indices 又名 index，帶有 barcode，每個 DNA 樣本都會有獨特的條碼。能同時將不同樣本放在同一個 Flow cell 多樣本大量定序，這樣子 Pooling 的方式稱為 Sample Multiplexing。像是大家帶著條碼手環泡在大眾池，這動作英文稱為 pooling，然後再拿著條碼器 (定序) 快速逼手環就知道誰是誰了。
- 帶有 Adapters 序列片段與 oligos 結合
- 聚合酶開始複製，使得草皮上的 oligos 被延長 後也長得與序列片段相同。被延長後的 oligos 稱為 Hybridized fragment (雜合片段)，再將原序列片段洗去，他不要了，只留下 lawn上的雜合片段。
- 因為另一端也與 lawn 上 oligos 互補，所以雜合片段會彎腰結合，形成像是橋 (Bridge) 狀的序列，接著聚合酶又來複製了，形成兩座 DNA 橋 (Double stranded bridge)
- 重複第 4~5 很多很多次，形成上百萬座橋
- 稱為橋式放大(Bridge amplification)。
- 然後就會獲得很多根巧克力棒，洗去紫色底座 oligos 上的雜合片段，留下藍色底座 oligos 上的雜合片段
- 紫色底座的序列都飛走惹，剩下藍色底座。
Part B – Forward 端定序
- 在開始定序前，3′ 端的 oligos 會用一小段序列擋住，因為這段序列是加上去的，不需要被定序，接下來，帶有四種螢光的 dNTP 加入到 Flow cell 中，只要結合到雜合片段，就會發光 ! 稱為 Sequencing by Synthesis (SBS) ，因為一邊合成一邊定序。
- 電腦就會偵測螢光出現的順序，進行讀取，其實超級漂亮的 !!
- 加入一段能辨識 indices 的 primer，再加入dNTP 與聚合酶，一樣用螢光讀取的方式獲得這些目標序列的 barcode。
- 稱為 Index Read。
- 洗去indices的primer 還有各種一切，留下巧克力棒 (Hybridized fragment)，Forward 定序讀完了，來讀 Reverse
- 稱為 Paired-End Sequencing。
Part C – Reverse 端定序
- 雜合片段彎腰與另一個 oligos 結合，並加入dNTP與聚合酶，
獲得 Reverse 的 Index (與 Forward Index相同) - 可愛聚合酶又登場啦，延長形成兩座 DNA 橋 (Double stranded bridge)，
其實有上百萬對橋 - 與 7. 相反，這次洗去 Forward oligos 上的雜合片段，
留下 Reverse oligos 上的雜合片段 - 同 8.，oligos 會用一小段序列去擋住，
因為這段序列是加上去的，不需要被定序 - 同 9.，一邊合成一邊定序 因為步驟與 Part C 類似，就不放動畫了，有興趣可以觀看 Illumina出品 的動畫。
Part D 初步資料分析
- Illumina 會利用演算法將這些上述 Barcode、80 bp 的破碎序列資訊，
分類並組成一條一條完整序列，
最終長度則是依照給予的樣本為定，
以本系列文章為例，我們選擇 16S V3~V4區域，
每個檔案的就會含有數萬條長度為 250 bp 的序列，
並且每個樣本會有 2 個檔案，
因為 Paired-End Sequencing 含有 Forward 與 Reverse，
檔案內也會根據螢光偵測到的波型完整度，
給予每個 mer 判定後的品質分數 (Quality score)。
