NGS QIIME2 : 繪製親緣關係樹 (Phylogenic tree) 與 iTOL 應用 -13

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畫出菌的族譜 – 菌與菌之間的距離

還記得 第一篇 放了一張酷酷的親緣關係樹嗎？今天要來繪製它！

Rooted Phylogenetic Tree 做生物資訊成就感之一就是看著一張張美美的圖產出。

親緣關係樹是藉由序列與序列之間的比對 (alignment) 得出，利用分子生物學角度繪製物種與物種之間的「距離」，蠻推薦從未手繪一棵「樹」的同學，可以修習關於序列比對的課程 (通常出沒在生物資訊學)，在檢視結果時會更有概念。

有根樹 (Rooted Tree) 與無根樹 (Unrooted Tree)

兩者使用時機依想解決的研究問題而定，有根樹因為所有序列的上游皆源自於一點，具有「追本溯源」的特性，帶有演化的方向性，適合應用在觀察演化的過程與關係。

Rooted Phylogenetic Tree，原來是迷宮阿，還以為是演化樹。

無根樹則無定義出演化的方向與路徑，著重在分類群之間的關係 (relationships among the taxa)，適合樣本內菌相差異極大(multispecies coalescent phylogenetic framework) 的觀察。(Kinene, Tonny, et al., 2016)

Unrooted Phylogenetic Tree

樹的製作

進入 qiime2-2022.8 環境後輸入 :

qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
  --i-sequences rep-seqs-dada2-240.qza \
  --o-alignment aligned-rep-seqs-240.qza \
  --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
  --o-tree unrooted-tree.qza \
  --o-rooted-tree rooted-tree.qza

–o-masked-alignment 是在產出樹的過程中，需遮罩 (mask)一些高度變異的序列避免造成過多噪點。

完成後會顯示:

'
Saved FeatureData[AlignedSequence] to: aligned-rep-seqs-240.qza
Saved FeatureData[AlignedSequence] to: masked-aligned-rep-seqs.qza
Saved Phylogeny[Unrooted] to: unrooted-tree.qza
Saved Phylogeny[Rooted] to: rooted-tree.qza
'

完成後主要會使用到 aligned-rep-seqs-240.qza、unrooted-tree.qza 及 unrooted-tree.qza

樹的視覺化

QIIME2 目前尚未提供樹的視覺化於 VIEW，於是這時候 iTOL 視覺化樹樹網就出場了！ (？因為他的功能過於強大，(這裡可以觀賞世界各地強者的美化樹樹結果)，這邊僅介紹常見功能~

需要的檔案 (先下載到本機端) :

taxonomy.qza : [第 11 篇] 分類器分析後的結果檔
table-dada2-240.qza : [第 08 篇] 品質管制後的結果檔 (終於要用上了)
aligned-rep-seqs-240.qza : 本篇熱騰騰產出來的
unrooted-tree.qza : 本篇熱騰騰產出來的
rooted-tree.qza : 本篇熱騰騰產出來的

愉快前往 iTOL 上傳檔案區，

上傳 rooted-tree.qza 或 unrooted-tree.qza 檔案: (這邊以 rooted-tree.qza 為例

一棵圓形的樹就這麼長出來了，如此突然，仔細看會發現都是以特徵 ID (Feature ID) 註釋 (差不多長這樣 311387e184d203ce7d2b0)，但人類根本看不懂，於是我們補上傳一些註釋資料 (Annoation)，在右側的 Datasets 上傳註釋資料 taxonomy.qza:

再上傳其他註釋資料 (上傳按鈕躲到最下面)

aligned-rep-seqs-240.qza、table-dada2-240.qza:

好了，這下已經非常繽紛了:

taxonomy.qza: 將特徵ID(Feature ID) 置換為物種名稱，
以及顯示信賴分數用長條圖表示

aligned-rep-seqs-240.qza: 顯示比對 (alignment) 中 mer 的差異
(只能在 Rectangular 顯示)

table-dada2-240.qza: 顯示不同樣本的對該序列的條數，以長條圖表示

iTOL 還提供三種呈現方式 Circular、Rectangular、Unrooted ，在右側控制板都能切換，選項功能很多，試著切換來切換去很好玩，而登入後可以保存之前上傳的資料，就能跑出以下漂漂的圖啦~

Circular / taxonomy.qza OFF / table-dada2-240.qza ON / Invert tree : Yes

Rectangular / taxonomy.qza : OFF / table-dada2-240.qza : ON / Invert tree : Yes

Rectangular / taxonomy.qza : ON / aligned-rep-seqs-240.qza : ON / Invert tree : NO

Circular / taxonomy.qza : OFF / table-dada2-240.qza : ON / Invert tree : Yes

實務上，我會拿來觀察極為相似序列的比對關係 (aligned-rep-seqs-240.qza)、未知物種的差異 (taxonomy.qza)，還有豐富度的比較 (table-dada2-240.qza)。

本篇使用到的檔案:
rep-seqs-dada2-240.qza、taxonomy.qza、table-dada2-240.qza、aligned-rep-seqs-240.qza、masked-aligned-rep-seqs.qza、unrooted-tree.qza、rooted-tree.qza

下回是繪製熱圖 (Heat map) !