NGS QIIME2 : 統計分析前樣本的取捨 – 取樣深度 (Sampling depth) -15

瀏覽次數: 112

可以去掉條數不多的樣本嗎? 取樣深度 (Sampling depth)

還記得 [第 09 篇] 提及的品質控制 (Quality control) 嗎?

在範例的檔案中，可以發現六個樣本經過篩選條數如下: (其實就是上圖中最右邊的條數)

樣本名	篩選後條數
CRC_A	24671
CRC_B	25003
CRC_C	50131
CRC_D	19914
CRC_E	21046
CRC_F	29772

可以挑掉剩餘條數不多的樣本嗎?

例如我們可以發現 CRC_D 19914 條數略少於其他組。而假設今天樣本 N=100 分成四組，總有一些定序後條數明顯少於其他樣本，因為後續將進行物種多樣性的分析統計等，深怕影響最終結果，希望能將一些樣本去除，畢竟條數少可能造成偏差 (Bias)。

如果你是生科相關科系學生，在做蛋白質定量法繪製標準曲線 (Standard curve) 時，若做了蠻多個點，可能也會刪去幾個讓 R^2 結果更漂亮 (笑 :

Reference : ZGENEBIO BIOTECH INC. 而取樣深度 (Sampling depth) 也有異曲同工之妙，刪去幾個各種原因造成的低序列數樣本，讓整體結果更有說服力

取樣深度要設多少? 低於多少需要挑掉?

這題並無標準答案，據 QIIME2 開發團隊表示，分析者必須在:留下最多的序列條數 (The most sequences) 及留下最多的樣本 (The most samples) 做平衡，如果樣本數少、當作練習、樣本很難採集，且條數差距不大(可能都有幾萬條)，可以考慮都留下，若樣本數多，動輒數百，則 QIIME2 提供取樣深度網頁拖拉服務，提供切一刀的數字參考 :

先將 [第 09 篇] 得到的 table-dada2-240.qza轉換為 qzv

qiime feature-table summarize \
  --i-table table-dada2-240.qza \
  --o-visualization table-dada2-240.qzv \
  --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv

完成後會顯示 :

'
Saved Visualization to: table-dada2-240.qzv
'

拖曳到 QIIME2 VIEW，右側有個滑桿~
可以依據組別進行觀察 (sample-metadata.tsv 中含有 Index 一人一組與 Sex)，
深度取的越深，留下來的樣本就越少(紅色代表該樣本會被篩掉)，

Index 個別樣本觀察。

Sex 組別觀察，可發現深度取越深，各組所剩的樣本數會開始不平均，以範例來說，會發現 Male 組樣本數會下降較多，所以該取多少是分析人要思考的問題。

在範例我們取 Sampling depth = 19914 ，也就是取最低的 CRC_D 值，即全數保留。

主因是樣本數很少 (N=6) 很可憐了，捨不得放棄他們，再者其實條數都算多，之後的稀疏分析 (Alpha Rarefaction) 會介紹，實務上，其實有上萬條都很足夠，但若遇到同採集條件的樣本卻只有一兩千條，就要思考要不要去除。

如果你心中叛逆的性格被挑起了，範例檔案可以設 19915，(即只高最低的樣本1，使得 N=5 )，不影響後續教學。而每次 QC 結果剩餘的條數因演算法關係，可能略有不同，就算同為範例檔案，也可能有個位數條數差異，所以在這裡深度以自己跑分析的結果為主。

怎麼辦，我有選擇困難，都有上萬條我不知道誰要留阿 QQ，覺得都好重要，都留下吧! ~~不然跟教授解釋200個樣本下去分析怎麼剩下150個也是蠻麻煩的~~，取樣深度取最低的樣本序列條數 = 全部保留 (翻找好多 QIIME2 社群問答歸納的結論XD)

本篇使用到的輸入/輸出檔案 :
Input : table-dada2-240.qza、sample-metadata.tsv
Output: table-dada2-240.qzv

拿起一張便條紙記下 Sampling depth，
以及最大的序列條數 (範例是: 50131) 之後會使用到~

下回是多樣性統計!